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一. Folin——酚試劑甲
溶液1):1:2g無水碳酸鈉溶于100m10.2mol/l氫氧化鈉中(以配制成 5X),用時稀釋5倍。
溶液2):0.5g 五水硫酸銅溶于100ml1%酒石酸鉀鈉(或酒石酸鈉)溶液。將稀釋后
的溶液 1 與溶液 2 ,以50:1的比例混合。混合后即為Folin——酚試劑甲,此試劑只
能用一天(tian),過期失效。
二.Folin——酚試劑乙
原溶液度為2moL/L使用前需稀釋一倍,用多少稀釋多少,使其zui后濃度為 1moL/L,
此為Folin——酚試劑乙應用液。Folin——酚試劑乙原液平時應封閉貯存于 4°C冰箱
中避光
保存(cun)。
三.操作方法
標準曲線的制作:取14支試管分成兩組,按下表順序加入試劑,混勻,于室溫
放置10分鐘。再加入0.5毫升試劑乙,立即搖勻,在室溫放置 30 分鐘,然后于
500nm 處比色。測定光密度值。取兩種測定的平均值,以蛋白質濃度為橫座標,
光密(mi)度值為(wei)
縱座(zuo)標(biao),繪制(zhi)標(biao)準曲線為
定量的依據。
試劑(ji)/管號 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
BSA/ml(250ug/ml | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸餾(liu)水/ml | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
試劑甲/ml | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
試劑(ji)乙/ml | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
樣品測(ce)定:
(1)取 1 毫升樣品溶(rong)液(約(yue)含 20-250微克多(duo)肽或蛋白(bai)質)加入 5 毫升試劑甲(jia)混勻,
于溫(wen)室放置 10 分(fen)鐘。
(2)加(jia)入0.5毫升試(shi)劑(ji)乙(Folin——酚),立即搖勻,于室溫(wen)保溫(wen) 30 分(fen)鐘(zhong):然后(hou)
500nm處比色,以 1 毫升水代替(ti)樣(yang)品(pin)作空白(bai)對照。測定后,可以從標準曲線中(zhong)查出
未知樣品濃度。若用 0.5 厘米光程的比(bi)色(se)杯進行(xing)比(bi)色(se),可按(an)下面(mian)方法進行(xing)操作(zuo):取
0.2 毫升樣品(pin)溶液(約含(han) 5-100微(wei)克(ke)多肽(tai)或蛋白質),加(jia)入 1 毫升試(shi)劑甲(可選(xuan)用(yong)
0.3-0.5 厘米直徑(jing)的小試(shi)管)混勻,10分鐘(zhong)以后,再加入 0.1 毫升試劑乙,立刻混
勻(yun),30 分鐘后(hou)比(bi)色一般(ban)來說(shuo),若(ruo)多肽或蛋白質濃(nong)度在 2-25 微克,則采(cai)用(yong)波長
755nm,而(er) 25 微(wei)克以上則采用 500nm 比色為宜(yi)。